マイクロアレイ (Agilent One-color microarry): Contributor S. Iwakiri
[1.Total RNA抽出(RNA抽出参照)]
[2.RNA clean up (Rneasy Mini kit - Quiagen)]
1. Total RNA solution 87.5μlに”buffet RDD” 10μlを加える
2. “DNaseⅠstock solution” 2.5μlを加える
3. 室温で10分間インキュベート
4. “Buffer RLT” 350μlを加え、転倒混合により撹拌
5. エタノール (96-100%) 250μlを加え、ピペッティングにより撹拌
6. RNeasy Mini spin columnにサンプルを700μl加える
7. 8,000×gで15秒間遠心分離
8. 濾液を捨てる
9. “Buffer RPE” 500μlを加える
10. 8,000×gで15秒間遠心分離
11. “Buffer RPE” 500μlを加える
12. 8,000×gで2分間遠心分離
13. カラムを新しい2ml collection tubeに移す
14. 15,000rpm (full speed)で1分間遠心分離
15. カラムを新しい1.5ml collection tubeに移す
16. RNase free water 30μlを加える(＊カラムの中心に)
17. 8,000×gで1分間遠心分離
18. 濾液をもう一度カラムに加える
19. 8,000×gで1分間遠心分離
[3.RNA quality check by spectrophotometer (Nano drop) and Bioanalyzer (Agilent Technologies)]
1. spectrophotometer ND-1000(Nano drop)でRNA濃度とクオリティーを確認する
2. Bioanalyzer (Agilent Technologies)を用いてRNAのクオリティーを確認する(付属プロトコール参照)
(＊クオリティーの基準：28S/18S > 1.3, RIN(RNA Integrity Number) > 9.5)
[4.cDNA synthesis and RNA labeling (One-Color RNA Spike-In Kit and Quick-Amp Labeling Kit – Agilent Technologies)]
1. 試薬準備
-“10mM dNTP”, ”DTT”, “T7 primer”, “Dilution buffer”, “One-color spike Mix”の5試薬を室温にて解凍
-“5×First strand buffer”を65℃で完全に融解後、室温インキュベート
2. “One-color spike Mix”が完全に融解したら、ボルテックス後スピンダウン
3. First solutionを作製
-“One-color spike Mix” 2μlと”Dilution buffer” 38μl (分量比 1:19)を混合
(＊first solutionは-80℃で2ヶ月間保管可能、ただし凍結融解は8回まで)
4. ボルテックス後スピンダウン
5. Second solutionを作製
-First solution 2μlと”Dilution buffer” 48μl (分量比 1:24)を混合
6. ボルテックス後スピンダウン
7. Third solutionを作製
-Second solution 3μlと”Dilution buffer” 27μl (分量比 1:9)を混合
8. ボルテックス後スピンダウン
9. RNAサンプルを氷上で溶解
10. PCR tubeを氷上に準備
11. ミクスチャー template and T7 promoter prime Mixを作製
[1サンプル分 (total 5.75μl)]
-“T7 promoter primer” : 0.6μl
-Third solution : 2μl
-Nuclease free water : 1.15μl
-RNA solution (100ng/μl) : 2μl
12. 65℃で10分間インキュベート
13. 氷上で5分間インキュベート
14. ミクスチャー cDNA master Mixを作製
[1サンプル分 (total 4.25μl)]
-“5×first strand buffer” : 2μl
-“0.1M DTT” : 1μl
-“10mM dNTP” : 0.5μl
-“MMLV-RT” : 0.5μl
-“RNase OUT” : 0.25μl
15. 40℃で2時間インキュベート(cDNA合成過程)
16. 65℃で15分インキュベート (酵素失活過程)
17. 氷上で5分間インキュベート
18. ミクスチャー Transcription Mater Mixを作製
[1サンプル分 (total 30μl)]
-Nuclease free water : 7.65μl
-“4×Transcription buffer” : 10μl
-“0.1M DTT” : 3μl
-“NTP Mix” : 4μl
-“50% PEG” : 3.2μl (使用前に40℃で1分間インキュベート)
-“RNase Inhibitor” : 0.25μl
-“Inorganic Pyrphospatase” : 0.3μl
-“T7 RNA polymerase” : 0.4μl
-Cynine3-CTP : 1.2μl
19. 各チューブに30μlのミクスチャーを加える
20. 40℃で2時間インキュベート (cRNA合成、Cy3ラベリング過程)
[RNA clean up (RNeasy Mini Kit- Qiagen)]
1. Nuclease free water 60μl を加える(final volume : 100μl)
2. 新しい1.5ml tubeに移す
3. “Buffer RLT” 350μlを加え、ピペッティングにより撹拌
4. エタノール (96-100%)を250μl加え、RNA mini columnに移す
5. 13,000×rpm、4℃で30秒間遠心分離
6. カラムを新しい1.5mlチューブに移す
7. “RPE buffer” 500μlを加える (Washing1)
8. 13,000×rpm、4℃で30秒間遠心分離
9. 濾液を捨てる
10. “RPE buffer” 500μlを加える (Washing2)
11. 13,000×rpm、4℃で1分間遠心分離
12. カラムを新しい1.5mlチューブ (Final tube)に移す
13. Nuclease free water 30μlを加える (＊カラムの中心に)
14. 常温で1分間維持
15. 13,000×rpm、4℃で30秒間遠心分離
16. spectrophotometer (Nano drop)でRNA濃度とCy3ラベリングクオリティーを確認する
(＊品質確認の基準：
①”μg cRNA yield” = “cRNA濃度×30μl / 1000” > 1.65μl,
②“pmol Cy3 / μg cRNA” = ”Cy3濃度 / cRNA濃度×1000” > 9 pmol Cy3 / μg cRNA)
[cRNA hybridization(the Agilent Gene Expression Hybridization Kit-Agilent Technologies)]
1. cRNAを600ng/20μlに希釈
2. “10×Blocking Agent” 5μlを加える
3. “25×fragmentation buffer” 1μlを加える
4. 60℃で30分間インキュベート
5. 氷上で1分間インキュベート
6. “2×GE×Hybridization buffer HI-RPM”を25μl加え、ピペッティングにより撹拌
7. 13000×rpmで1分間遠心分離
8. マイクロアレイスライドへ40μl加える
9. カバースライドを重ね、チャンバーで固定する
10. 65℃で17時間インキュベート
11. “GE Wash Buffer 1”の中でスライドを剥離後、別の染色瓶に入れ替え同Wash buffer内で1分間スターターを用いてWashing
12. “GE Wash Buffer 2”の中で、1分間スターターを用いてWashing
13. スライドをボックスに入れ、窒素封入後スキャニング
［備考］
“X”はキット付属の試薬、なお試薬の保管条件はキットプロトコール参照