愛媛大学沿岸環境科学研究センター　生態系解析部門
愛媛大学理学部　生物学科

随時アップしていきます。

フェノクロのプロトコル (pdf)

Contributor: T.Hamada

クローニング・シーケンス プロトコル（PDF）

マイクロアレイ (Agilent One-color microarry): Contributor S. Iwakiri

[1.Total RNA抽出(RNA抽出参照)]

[2.RNA clean up (Rneasy Mini kit - Quiagen)]

1. Total RNA solution 87.5μlに”buffet RDD” 10μlを加える

2. “DNaseⅠstock solution” 2.5μlを加える

3. 室温で10分間インキュベート

4. “Buffer RLT” 350μlを加え、転倒混合により撹拌

5. エタノール (96-100%) 250μlを加え、ピペッティングにより撹拌

6. RNeasy Mini spin columnにサンプルを700μl加える

7. 8,000×gで15秒間遠心分離

8. 濾液を捨てる

9. “Buffer RPE” 500μlを加える

10. 8,000×gで15秒間遠心分離

11. “Buffer RPE” 500μlを加える

12. 8,000×gで2分間遠心分離

13. カラムを新しい2ml collection tubeに移す

14. 15,000rpm (full speed)で1分間遠心分離

15. カラムを新しい1.5ml collection tubeに移す

16. RNase free water 30μlを加える(＊カラムの中心に)

17. 8,000×gで1分間遠心分離

18. 濾液をもう一度カラムに加える

19. 8,000×gで1分間遠心分離

[3.RNA quality check by spectrophotometer (Nano drop) and Bioanalyzer (Agilent Technologies)]

1. spectrophotometer ND-1000(Nano drop)でRNA濃度とクオリティーを確認する

2. Bioanalyzer (Agilent Technologies)を用いてRNAのクオリティーを確認する(付属プロトコール参照)

(＊クオリティーの基準：28S/18S > 1.3, RIN(RNA Integrity Number) > 9.5)

[4.cDNA synthesis and RNA labeling (One-Color RNA Spike-In Kit and Quick-Amp Labeling Kit – Agilent Technologies)]

1. 試薬準備

-“10mM dNTP”, ”DTT”, “T7 primer”, “Dilution buffer”, “One-color spike Mix”の5試薬を室温にて解凍

-“5×First strand buffer”を65℃で完全に融解後、室温インキュベート

2. “One-color spike Mix”が完全に融解したら、ボルテックス後スピンダウン

3. First solutionを作製

-“One-color spike Mix” 2μlと”Dilution buffer” 38μl (分量比 1:19)を混合

(＊first solutionは-80℃で2ヶ月間保管可能、ただし凍結融解は8回まで)

4. ボルテックス後スピンダウン

5.  Second solutionを作製

-First solution 2μlと”Dilution buffer” 48μl (分量比 1:24)を混合

6. ボルテックス後スピンダウン

7.  Third solutionを作製

-Second solution 3μlと”Dilution buffer” 27μl (分量比 1:9)を混合

8. ボルテックス後スピンダウン

9. RNAサンプルを氷上で溶解

10. PCR tubeを氷上に準備

11. ミクスチャー template and T7 promoter prime Mixを作製

[1サンプル分 (total 5.75μl)]

-“T7 promoter primer” : 0.6μl

-Third solution : 2μl

-Nuclease free water : 1.15μl

-RNA solution (100ng/μl) : 2μl

12. 65℃で10分間インキュベート

13. 氷上で5分間インキュベート

14. ミクスチャー cDNA master Mixを作製

[1サンプル分 (total 4.25μl)]

-“5×first strand buffer” : 2μl

-“0.1M DTT” : 1μl

-“10mM dNTP” : 0.5μl

-“MMLV-RT” : 0.5μl

-“RNase OUT” : 0.25μl

15. 40℃で2時間インキュベート(cDNA合成過程)

16. 65℃で15分インキュベート (酵素失活過程)

17. 氷上で5分間インキュベート

18. ミクスチャー Transcription Mater Mixを作製

[1サンプル分 (total 30μl)]

-Nuclease free water : 7.65μl

-“4×Transcription buffer” : 10μl

-“0.1M DTT” : 3μl

-“NTP Mix” : 4μl

-“50% PEG” : 3.2μl (使用前に40℃で1分間インキュベート)

-“RNase Inhibitor” : 0.25μl

-“Inorganic Pyrphospatase” : 0.3μl

-“T7 RNA polymerase” : 0.4μl

-Cynine3-CTP : 1.2μl

19. 各チューブに30μlのミクスチャーを加える

20. 40℃で2時間インキュベート (cRNA合成、Cy3ラベリング過程)

[RNA clean up (RNeasy Mini Kit- Qiagen)]

1. Nuclease free water 60μl を加える(final volume : 100μl)

2. 新しい1.5ml tubeに移す

3. “Buffer RLT” 350μlを加え、ピペッティングにより撹拌

4. エタノール (96-100%)を250μl加え、RNA mini columnに移す

5. 13,000×rpm、4℃で30秒間遠心分離

6. カラムを新しい1.5mlチューブに移す

7. “RPE buffer” 500μlを加える (Washing1)

8. 13,000×rpm、4℃で30秒間遠心分離

9. 濾液を捨てる

10. “RPE buffer” 500μlを加える (Washing2)

11. 13,000×rpm、4℃で1分間遠心分離

12. カラムを新しい1.5mlチューブ (Final tube)に移す

13. Nuclease free water 30μlを加える (＊カラムの中心に)

14. 常温で1分間維持

15. 13,000×rpm、4℃で30秒間遠心分離

16. spectrophotometer (Nano drop)でRNA濃度とCy3ラベリングクオリティーを確認する

(＊品質確認の基準：

①”μg cRNA yield” = “cRNA濃度×30μl / 1000” > 1.65μl,

②“pmol Cy3 / μg cRNA” = ”Cy3濃度 / cRNA濃度×1000” > 9 pmol Cy3 / μg cRNA)

[cRNA hybridization(the Agilent Gene Expression Hybridization Kit-Agilent Technologies)]

1. cRNAを600ng/20μlに希釈

2. “10×Blocking Agent” 5μlを加える

3. “25×fragmentation buffer” 1μlを加える

4. 60℃で30分間インキュベート

5. 氷上で1分間インキュベート

6. “2×GE×Hybridization buffer HI-RPM”を25μl加え、ピペッティングにより撹拌

7. 13000×rpmで1分間遠心分離

8. マイクロアレイスライドへ40μl加える

9. カバースライドを重ね、チャンバーで固定する

10. 65℃で17時間インキュベート

11. “GE Wash Buffer 1”の中でスライドを剥離後、別の染色瓶に入れ替え同Wash buffer内で1分間スターターを用いてWashing

12. “GE Wash Buffer 2”の中で、1分間スターターを用いてWashing

13. スライドをボックスに入れ、窒素封入後スキャニング

［備考］

“X”はキット付属の試薬、なお試薬の保管条件はキットプロトコール参照

DNA抽出(GenElute^TM Mammalian Genomic DNA Miniprep kitを用いた例): Contributor A. Onami

1. サンプル（細胞、組織、血液、白血球など）をエッペンチューブに入れ，Resuspension solution を200μℓ 加える．
2. Protease K を 20μℓ加える．
3. Lysis solution を 200μℓ加える．
4. よくvortexを行った後，70℃で10分 処理する．

＊55℃ 2時間もしくは，36℃ オーバーナイトでも可

1. 上記の処理中にカラムチューブを準備し，カラムPreparationを 500μℓ加え，10,000×gで 1分遠心し，下の液を捨てる．
2. 70℃ 10分 処理後のサンプルにEthanol を200μℓ 加え，よくvortexを行った後，サンプルをすべてカラムチューブに移す．
3. カラムチューブを10,000×gで1分遠心した後，カラムを新しいエッペンチューブに移す．
4. カラムにWash solutionを500μℓ加え，10,000×g で1分遠心する．
5. 下の液を捨て再びWash solutionを500μℓ加え，10,000×gで 1分遠心する．
6. 下の液を捨てそのまま10,000×g で3分 遠心する．
7. 下の液を捨てElution buffer 100μℓをカラムの中心に加え，5分静置した後 10,000×gで1分遠心する．

［備考］

【-20℃で保存試薬】

Protease K

【常温で保存】

Resuspension solution

Lysis solution

Ethanol

Wash solution

Elution buffer